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技术支持 |
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| 用户名：wisegen |
主题：我的实验是同时做DNA与siRNA的转染,该试剂是否同时适用? |
时间：2007-3-13 21:13:35 |
| 内容：请解释。 |
| [回复]：GenEscort基因转染试剂是可降解的阳离子聚合物（PEI）试剂，它是利用其正电性与负电性的DNA或RNA结合，将DNA或RNA压缩包装成小于200nm的小颗粒，然后被胞吞进入细胞内的，所以它不识别DNA或RNA片段，还是它们的质粒，当然可以将不同的质粒或片段共转染。如果是负电性的蛋白质理论上也可以用该试剂转入细胞内。siRNA实验当然可以用我们的试剂，siRNA的质粒或片段都可以，一般是化学合成的片段转染效率更高。 |
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| 用户名：wisegen |
主题：网上的操作说明只介绍了DNA的转染,是否有用于SiRNA转染实验的具体条件或实例? |
时间：2007-3-13 21:14:48 |
| 内容：网上的操作说明只介绍了DNA的转染,是否有用于SiRNA转染实验的具体条件或实例? |
| [回复]：DNA的转染和SiRNA转染实验是一样的操作方法。可以在我们的网站上注册申请获得免费试用，同时注册后就可以在“产品应用”栏目里看到有关RNA干扰实验的文章，全文共计23页，内容非常详细。 |
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| 用户名：wisegen |
主题：如何获得即简捷又高效的转染方法? |
时间：2007-3-13 21:30:52 |
| 内容：我们实验室经常做转染的同事说，不需要严格按使用说明上的转染方法进行转染实验，据说贵公司技术支持教他们了一种即简捷又高效的转染方法，请介绍一下这种转染方法且解释一下这样做的原理？ |
| [回复]：我们随产品发给用户的英文说明书是针对初次做转染用户而写的，所以操作步骤详细且保守，但对已经熟练进行转染的用户有些步骤就显得不必要了。例如 在中文“使用说明”中下面的步骤可以合并为一步完成（24孔板为例）
0.5-1 μg DNA质粒稀释于50 μl 不含血清和抗生素的培养基中或PBS中，轻轻混匀。
1-2 μl GenEscort™ 试剂 稀释于50 μl 不含血清和抗生素的培养基中或PBS中，轻轻混匀。
然后将 稀释好的50 μl GenEscort™ 试剂加入稀释过的50 μl DNA质粒溶液中混合均匀，室温放置10-15 min，获得100μl 转染复合物。
为简化操作，在充分注意及时混匀的前提下（必须是用合适大小的枪，如100 μl的枪吸打5次以上，进行混合，绝不能用吸取DNA的10μl枪进行混匀），一般前面几步可以合并为一步完成：将0.5-1 μg DNA 质粒稀释于100 μl 不含血清和抗生素的培养基中或PBS中，轻轻混匀，然后加入1－2 μl GenEscort 试剂 后立刻混匀，室温放置10-15 min，获得100 μl 转染复合物。
为了提高转染效率，可以将已经放置过夜的细胞培液弃去，换为新鲜的含血清的培液，对24孔板，每孔可以先加入200 μl 含血清的培液，然后加入已经配制好的前述 DNA与GenEscort试剂的转染复合物100 μl ，在低培养基体积下（200 μl 含血清的培液和100 μl 前述 DNA与GenEscort试剂的转染复合物）使细胞生长4小时，然后补加600 μl 含血清的培液继续培养24－48 h, 收获细胞进行评价。
以上操作的原理解释如下，DNA必须与GenEscort试剂及时且充分混合以便形成小于几百nm的小颗粒后才能被胞吞，所以二者的比例和及时混匀非常必要。所做的操作应该确保DNA/RNA已经被全部地包裹了，而且只有少量的剩余GenEscort试剂处于游离状态（free PEI）。这些DNA/RNA与GenEscort试剂形成的转染复合物在水溶液里和低培养基体积下4－6 h内不会发生聚集，在低培养基体积下分子热运动可以使它们易于与贴臂细胞接触，而它们在4－6 h 内却可以完成跨膜转染，一般6 h 后，复合物开始发生聚集，所以在4 h 时补加培液稀释，可以减轻聚集，从而提高转染效率。其实我们的说明书上也介绍了这种方法，只是希望在做难转染细胞时用上述方法，因为对293这样的易于转染的细胞就没有必要这样做了。
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| 用户名：wisegen |
主题：如何获得即简捷又高效的转染方法? |
时间：2007-3-13 21:39:27 |
| 内容：我们实验室经常做转染的同事说，不需要严格按使用说明上的转染方法进行转染实验，据说贵公司技术支持教他们了一种即简捷又高效的转染方法，请介绍一下这种转染方法且解释一下这样做的原理？ |
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| 用户名：wisegen |
主题：减少使用GenEscort III 试剂的用量后，毒性不仅减小且转染效率也提高了，这是为什么？ |
时间：2007-4-5 11:26:25 |
| 内容：减少使用GenEscort III 试剂的用量后，毒性不仅减小且转染效率也提高了，这是为什么？
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| [回复]：在做常规细胞转染时，对大多数质粒或DNA/RNA片段，我们推荐的质粒或DNA/RNA片段与GenEscort的质量比优化条件是1：2－3, 但这是一般情况，质粒不同，所转染的细胞不同及定量的准确性等因素会导致在一些情况下所做的转染不在该优化条件内。我们的经验是对一些细胞，在使用某个质粒时可以在1：1.5时达到最佳转染效果，例如B16F10细胞。而大鼠肾小球系膜细胞(HBZY－1)，却在1：5时有最佳的转染效果。要达到较高的转染效率，质粒或DNA/RNA片段与GenEscort的质量比是非常重要的，如果GenEscort试剂的用量过大，其结果是，转染体系中有过多的没有与质粒或DNA/RNA片段进行包裹的自由的GenEscort试剂（也就是free PEI）,研究表明这些free PEI导致较大的细胞毒性。如果GenEscort试剂的用量过少，会有大量的质粒或DNA/RNA片段没有被包裹，free DNA/RNA的转染效率是非常低的，因此导致转染效率下降。free PEI引起细胞毒性的机理可以进一步参考下列文章：
1. S. Moein Moghimi, Peter Symonds, J. Clifford Murray et al. A two-stage poly(ethylenimine)-mediated cytotoxicity: implications for gene transfer/therapy Molecular Therapy 2005, 11 (6): 990-995
2. I. P. Clamme, I. Azoulay and Y. Mely Monitoring of the formation and dissociation of polyethylenimine/DNA complexes by two photon fluorescence spectroscopy. Biophys. J. 2003, 84: 1960-1968
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| 用户名：chpsi |
主题：关于人外周血T淋巴细胞的转染 |
时间：2007-4-6 5:32:46 |
| 内容：我目前正在进行的实验是要通过RNAi技术knockdown 人外周血T淋巴细胞（新鲜分离）的某个组成性表达的基因，并通过RT－PCR和Western blotting检测结果。
请问用什么方法转染T细胞好？用贵公司的产品能转染T细胞吗？转染率是多少？有成功的案例和protocal提供吗？
盼望回音！
谢谢！ |
| [回复]：类似的实验在其他细胞系做过，具体请见我们网站产品应用栏目。但在T淋巴细胞上至今还没有试过，可以试一试，T淋巴细胞难转染，所以应该参考附件内容。祝顺利！ |
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| 用户名： |
主题：关于基因转染 |
时间：2007-8-23 22:08:27 |
| 内容：我是一名刚开始做课题的研究生，想问一下，如果我的课题里面需要做基因转染这一项，1 寡核甘酸的合成与纯化2阳离子脂质体转染 这两步做下来大概价格是多少 |
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