GenEscort®转染试剂如何使用才能确保转染效率高？下文的“10个问与答”详细阐述了这个提问：

       1．GenEscot®试剂的一般用途是什么？什么是GenEscort®®I, GenEscort®II和GenEscort®III试剂？

      GenEscort®是一系列非脂质体型转染试剂，是自行设计、合成和纯化的可生物降解的分枝型PEI衍生物。分枝型结构大大地提高了传统的PEI类转染试剂的转染效率，而其在生理条件下的生物降解性能又极大地降低了传统PEI产品的细胞毒性，是目前最高效的、最安全的非病毒性转染载体。因此具有许多传统转染试剂所不具有的优点，如可以用于小鼠体内转染，通过静脉、大脑、腹膜及气管等体内途径进行转染均取得了高的转染效果。可以在-20°C下长期储存不影响其转染效率。转染过程中受血清影响小，可在血清存在下保持高的转染效率。可以在高盐浓度下取得高效的转染，对DNA纯度要求不高。可以用含NaCl 的PBS（pH 7.4）或不含血清的培养基做稀释剂制备转染试剂—DNA复合物，混合均匀，10-15 min后直接加入到含血清的细胞培液中既可完成转染实验，转染过程中可以不换液，因此操作十分简便。适用于将基因运送到不同的细胞或组织中，适合做长效和瞬时转染。

    GenEscort®III体内基因转染试剂 对绝大多数贴壁细胞系具有优秀的转染效率，可以转染原代细胞和悬浮细胞，可进行寡核苷酸和siRNA运送，可应用于高通量系统。转染效率和适用范围较GenEscort®II大，同时也是基因治疗的理想非病毒载体，适用于将基因运送到不同的组织中，特别适用于小鼠的肌肉和肿瘤原位注射。

    GenEscort®II对绝大多数贴壁细胞系具有优秀的转染效率，可以转染原代细胞和悬浮细胞，可进行寡核苷酸和siRNA运送。

GenEscort®I是针对贴壁细胞设计的经济型产品，是分枝状PEI衍生物，特别适用于一些常用细胞系的转染实验。适用范围较小，但转染效率同样高。

 

      2.  GenEscort®试剂如何工作？

      GenEscort® 是一种非脂质体型转染试剂，由自行设计、合成和纯化的可生物降解的分枝型PEI衍生物和特定成分组成。在增加核酸稳定性的同时，提高转染试剂—DNA复合物穿越细胞膜的效率，在生理条件下可以生物降解，这一创新性的设计，预示了将整个转染过程对正常细胞生理功能的影响减到最小。这些是其他传统转染试剂所不能达到的。转染试剂—DNA复合物可以直接加入完全细胞培养基中，血清和抗生素不影响其转染效果，而且转染前后可以不更换培养基，不去除转染试剂。该产品配方与DNA、小分子Oligos DNA和RNA等能形成稳定的较小的纳米胶体颗粒，与细胞表面的蛋白多糖结合，通过细胞“内吞作用”进入细胞，具有质子海绵的特性，能吸收溶酶体的H⁺，在复合物中形成酸性环境，使核酸酶失活，保护DNA免受核酸酶的降解。进入细胞后，复合体囊泡肿胀破裂，将DNA释放到细胞质中。适合广泛的贴壁细胞基因转染，可以转染原代培养细胞，以及Jurkat，K562等悬浮细胞。

 

      3. 那类GenEscort®试剂对某个细胞株作了有效转染？不同的GenEscort®试剂对不同的细胞株转染最有效？

      对一个细胞株使用哪种转染试剂最有效，需通过实验来确定，GenEscort®转染试剂盒为这种选择提供了各类GenEscort®试剂的测试样品，转染辅助网页提供了用WiseGen公司的转染试剂成功地转染细胞株的转染条件。 例如GenEscort®I 转染HEK293，COS7，A549最有效，通常可以达到近90％的转染效率，GenEscort® II转染Hela, B16F10, HLF最有效, ，通常可以达到80％以上的转染效率。

 

     4. 用GenEscort®试剂能成功转染悬浮细胞吗？

     用GenEscort®II 和GenEscort® III试剂已经成功地转染了Jurkat，K562等悬浮细胞。但与GenEscort®II比，GenEscort® III的适用范围更广，转染效率也更高。转染悬浮细胞的条件与转染附着细胞一样，需做优化。

 

     5.  GenEscort®试剂能用于制备稳定转染细胞株吗？

是。用有效地获得瞬时表达的条件转染细胞株，制备了几种抗药细胞株。比如，将带有新霉素磷酸转移酶基因（NPT）的pCI-neo载体转染到细胞中，用G-418抗菌素筛选表达NPT基因的细胞。

 

     6. 在第一次使用GenEscort®试剂转染一个特定的细胞株时，需对哪些因素作优化？

    当首次使用GenEscort®试剂时，可对3个主要的因素做优化（以24孔培养版为例）：

（1）GenEscort®试剂与DNA的（体积:质量）比，一般为1.5:1-5:1。

（2）所用DNA的量，一般为0.5-1μg，通常是1μg，酚/氯仿手工方法提取的DNA可能需要2μg

（3）细胞接触GenEscort®试剂-DNA转染复合物的时间，一般为４－６小时，然后，除去转染复合物（GenEscort®试剂-DNA），让质粒在完全培养基下表达２４－７２小时。

 

     7. 电荷比如何？什么是优化的好的起始指标？

电荷比指的是GenEscort®试剂的胺基正电荷与DNA磷酸基团的负电荷的（N/P）比值。总的正电荷必需超过总的负电荷。这使GenEscort®试剂与DNA结合形成的纳米颗粒带正电荷，这有利于GenEscort®试剂/DNA复合物与靶细胞表面带负电荷的膜相互作用。对大多数细胞系，一般GenEscort®试剂与DNA的(体积:质量)比为2:1-4:1为其优化结果。

 

     8.DNA如何影响转染？什么是优化的好的起始指标？

市场上的大多数转染试剂均对DNA纯度有较高的要求，并且认为是转染效率的重要影响因素。要求质粒必须不含残留蛋白，RNA及化学试剂。用大多数销售的过柱方法的试剂盒提取的质粒会有残留的内毒素。内毒素是大肠杆菌及其他革兰氏阴性细菌外细胞膜的多脂多糖主份（LPS）。一些细胞株较其他细胞株对质粒样品中的内毒素更敏感。在一些条件下，残留内毒素使细胞株用任何一种转染试剂的转染效率降低。用一些方法可有效减少残留内毒素，比如用氯化铯密度超离心或用WizardPurefection 质粒DNA纯化方法。但大量实验表明GenEscort®转染试剂对DNA纯度要求不高，一般过柱方法提取的质粒或传统手工提取的质粒均能满足使用的需要。所用DNA的最适量取决于DNA的类型及转染的特定的DNA。将乙醇沉淀的DNA溶于水或TE缓冲液中，终浓度为0.2-1mg/ml。比如用24孔板培养的HEK293细胞用GenEscort®I试剂将1μg  pEGFP-C1 (Clontech) DNA成功地转染，流式细胞仪分析表明转染细胞的阳性率达到90％，而且重复性很好。NIH/3T3细胞用GenEscort®®II试剂将1μg同样DNA成功地转染。建议用0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0 μg DNA对24孔板培养的附着细胞进行优化转染条件。一般1-2μg DNA对24孔板培养的附着细胞有较好的转染效率，增加转染DNA的量不一定导致更高的转染效率。

 

      9. 转染培养基含有血清吗？

      一般情况下转染培养基中含血清会影响效果，为达到最佳转染效果，细胞接触GenEscort®试剂-DNA转染复合物的时间，为４－６小时，然后，除去转染复合物（GenEscort®试剂-DNA），让质粒在完全培养基下表达２４－７２小时。

 

      10. 不需对转染指标做优化，什么是使用GenEscort®试剂好的起始指标？

      如果您希望取得最佳的转染效果，WiseGen公司极力建议优化GenEscort®试剂的转染因素，最先，改变转染DNA的量（0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0 μg DNA每孔/24孔板），体积:质量比为GenEscort®试剂:DNA为2:1。转染可用附着细胞，无血清转染，转染试剂/DNA的转染复合物形成时间为15-20 min。在一个24孔板中测试各种GenEscort®试剂（每一个DNA浓度重复3次），一旦确定最佳DNA的浓度，可进一步改变GenEscort®试剂:DNA比（2:1-4:1）。