基因治疗中的非病毒型载体研究进展
刘文生, 刘桂林,卫 萍
(山西农业大学农学院，山西太谷030801)
摘 要：基因治疗载体一般分为病毒性载体和非病毒性载体。由于病毒型载体存在安全性问题，目前非病毒性载体的研究越来越受到人们的重视。非病毒载体是新兴的基因转导系统，具有低毒、低免疫反应、外源基因整合几率低、无基因插入片断大小限制，以及使用简单、制备方便、便于保存和检验等优势。脂质体作为常用的非病毒性载体容易制备，安全性高，却难达到质控要求，体内基因导入效率低，且无靶向性，使得其应用受到限制。pH敏脂质体、阳离子脂质体等大大提高了脂质体的转运效率。同时高分子载体、纳米基因转运体在基因治疗中的应用，也为非病毒载体在临床上的应用开辟了广阔的前景。
关键词：基因治疗；高分子载体；脂质体；纳米基因载体
基因治疗的目的是将遗传物质导入细胞内以纠正胞内基因的缺陷或补充其不足,从而达到治疗遗传性或感染性疾病的目的,有效的基因导入法是基因治疗应用的必要条件之一。病毒性载体虽然效率高，但其安全性问题限制了它的应用。而非病毒型载体则具有安全、易于制备等优点，更易于被人们接受。现简述脂质体、高分子载体、纳米基因转运体等在基因治疗中的应用。
1 脂质体
脂质体是由脂双分子层组成的颗粒，可介导基因穿过细胞膜。通过脂质体介导比利用病毒转导进行基因转移具有以下明显的优势:①脂质体与基因的复合过程比较容易;②易于大量生产;③脂质体是非病毒性载体，与细胞膜融合将目的基因导入细胞后，脂质即被降解，无毒，无免疫原性;④DNA或RNA可得到保护，不被灭活或被核酸酶降解;⑤脂质体携带的基因可能转运至特定部位;⑥体外和体内试验都表明，接近染色体大小的DNA片段也能被转运至宿主基因组中并增长;⑦转染过程方便易行，重现性好。
脂质体是具有双层膜的封闭式粒子，自身聚集性脂类分子包封内水相介质，可分为大、小多层，寡多层和单室脂质体，医学应用较多为小单室脂质体。基于脂质体作为药物载体系统的经验，理想的用于转运基因的脂质体，对于质粒DNA具有高包封率，保护DNA不被血浆核酶降解的特点，它们粒径分布范围窄，粒径平均为100 nm或者更小。为使脂质体接近血管外区域，故采用具有广泛的结合潜力脂类，这种特殊脂类可促进与细胞膜融合和/或提高脂质体在循环系统中的稳定性。第1种为传统上的脂质体，人们可控制其体外行为，但不能控制其体内行为，它们很快被灭活或被固定;第2种为无活性脂质体(即不与外界作用)，由于聚合物包封于表面的立体稳定性而抑制其相互作用;第3种脂质体表面结合抗原、凝集素或其他基团，由于表面结合的特定配基，也可特定地相互作用;第4种为反应活性脂质体，如离子型、靶敏感型和融合性脂质体，这种脂质体有时指相转变的多孔脂质体，脂质体内有离子敏感亚基，Ca2+ 其他金属离子敏感性脂质体，也包括阳离子脂质体，阴离子脂质体。阴离子脂质体不属于有反应活性类，但特殊的试验如试管内与相反电荷(多)离子相互作用例子除外[1]。
常规脂质体进入细胞转运DNA实验，其原理是脂质体增强细胞体的聚集，即加速大分子、荷电多的分子透过膜，该过程相当复杂，尤其在包封较大片段时，在实践中这种技术只在体外使用且要用融合剂，荷电越多用途越少。
2 pH-脂质体
pH-脂质体是一种具有细胞内靶向和控制药物(如基因、核酸、肽、蛋白质)释放的功能性脂质体。其原理是pH低时可导致脂肪酯羧基的质子化而引起六角晶相的形成，这是膜融合的主要机制。在酸性条件下，即在核内体(endosome)形成后几分钟内，进入溶酶体之前， pH从7.4减至5.3时～6.3时，pH-脂质体膜发生结构改变，促使脂质体膜与核内体/溶酶体膜的融合，将包封的物质导入胞浆及主动靶向病变组织，避免网状内皮系统的清除［2］。制成pH-脂质体可在一定程度上避免溶酶体降解并增加包封物摄取量和稳定性。
3 脂质体/ＤＮＡ复合体系
最常用的脂质体为阳离子脂质体，主要由带正电荷的脂类和中性辅助脂类等摩尔混合。阳性电荷的脂质体与带阴性电荷的DNA之间可以有效地形成复合物，通过内吞作用使复合物可进入细胞中。多聚物即利用阳离子多聚体如多聚左旋赖氨酸上的正电荷与DNA上的负电荷结合发生电性中和，而形成稳定的多聚物/DNA复合物。复合物仍带正电荷，可与细胞表面带负电荷的受体结合，而被摄入到细胞中。
研究人员对负电荷的DNA与正电荷的脂质体通过静电相互作用形成的复合物的结构进行了广泛深入的研究［3］。Ｒdler J O等［4］以同步辐照小角Ｘ射线衍射(SAXS)研究了λ噬菌体DNA与脂质复合物的结构。他们提出一种多夹层结构,DNA交替地嵌入到脂质双层内形成二维近晶型液晶。试验中发现结构参数随DNA与脂质的配比而变化。Ｋuhn P S等［5］通过理论计算发现，阳离子表面活性剂的加入会产生协同结合转变,且转变点远低于临界胶束浓度,进一步加入阳离子表面活性剂导致复合物荷电性的逆转。这对于体内基因释放是十分有意义的,因为以往形成DNA复合物时需足够高浓度的脂质体,但是高浓度的脂质体会产生毒性反应。Kuhn的理论模型表明，如果阳离子表面活性剂具有足够的疏水性,则相当低的浓度会使DNA复合物电荷反转,易于进入细胞膜,减小不必要的风险[6]。
4 阳离子高分子载体
阳离子高分子载体是通过电荷相互作用与带负电的DNA分子形成聚电解质复合体（polyelectrolyte complexes）,复合物通过内吞或内噬作用进入细胞，在细胞内紧密的复合物可以保护DNA免受核酸酶的降解。一般细胞通过胞吞摄取DNA/高分子复合物。胞吞是一个复杂的过程，包括结合、内在化（internalization）、形成内体（endosome）、溶酶体融合和裂解等。内体中的pH为5.5，在pH为5～7的具有高缓冲力的阳离子高分子如聚乙烯亚胺（PEI）具有较高的转染率。近年来各种天然和合成的阳离子高分子用作基因传递系统[7],包括PEI[8]、聚酰胺胺树形高分子（dendrimer） [9]、脱乙酰壳多糖（chitosan）[10]、明胶[11]、阳离子多肽[12]、阳离子聚酯[13]、阳离子聚磷酸酯[14]、聚乙烯基吡啶盐、聚（二甲氨基）乙基甲基丙烯酸酯等。
另外一些两亲性高分子如聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙烯醇（PVA）和三嵌段聚合物PEO-TO-EO，其亲水性部分通过氢键、范德华力等与DNA分子相互作用。疏水性部分覆盖在DNA分子周围，导致DNA表面具有一定疏水性PVP，PVA与DNA在生理盐水中相互作用，可以在一定程度上增加DNA的稳定性[15]。
最近，两名日本研究人员以螃蟹壳等所含的脱乙酰壳多糖为基础，与要植入的基因结合在一起，成为一种DNA复合体，其表面还附着一层黏着乳糖氧化物或麦芽糖氧化物等糖链的聚乙二醇。由糖分子连接起来的糖链，特别是麦芽糖容易和细胞表面的蛋白质结合，从而能够提高基因植入的效率。此外，这种新型载体带有负电荷，因此不容易与血液里带负电荷的蛋白质结合在一起形成血栓。
两位科学家使用这种载体进行转基因试验时，把萤火虫的基因植入到老鼠的特殊细胞里，结果表明，其效率比一般的载体要高约130倍。据专家认为，这一技术可应用到动、植物的转基因操作及基因疗法上。
5 纳米基因载体
用纳米生物技术治疗恶性肿瘤是目前国际肿瘤研究领域的一个重要方向。有关专家已经研究出一批粒径小、分布均匀、形态规则的纳米基因载体。成功研制的这种纳米基因载体将成为一种良好的基因治疗载体，为人类最终攻克恶性肿瘤及其他遗传性疾病奠定基础[16]。常津等[17-8] 采用纳米生物技术制备了一系列抗癌药物的控释载体,聚乳酸O-甲基壳聚糖用超声波法制备成纳米微球,并将其携带寡核苷酸转染ＴＪ905人脑胶质瘤细胞,通过一系列的方法对细胞的转染情况进行体外检测,以探讨其作为非病毒基因载体的可能性。聚乳酸和O-甲基壳聚糖是两种性质不同的高分子材料,将二者结合作为新的非病毒基因载体有如下优点:①聚乳酸和O-甲基壳聚糖都是具有良好生物相容性和生物降解性的高分子材料,对人体无毒无害;②由于O-甲基壳聚糖带正电荷,使其能通过静电吸附作用携带带负电荷的基因物质如寡核苷酸,从而通过空间位阻效应,防止体内ＤＮＡ酶对寡核苷酸的降解;③O-甲基壳聚糖为水溶性高分子,可解决基因载体制备和转染过程中的沉淀问题;④O-甲基壳聚糖为多糖类物质,可与某些肿瘤表面的多糖受体结合,增加该类基因载体的肿瘤靶向性;⑤聚乳酸带负电荷, O-甲基壳聚糖带正电荷,将二者制备成纳米微球,可调节微球结构中正负电荷的比例,从而降低由过强正电荷产生的载体本身的细胞毒性;⑥聚乳酸和O-甲基壳聚糖都是可生物降解的高分子材料,可通过纳米生物技术达到基因的控制释放,从而使基因治疗达到最佳效果。
据最新的研究报道,壳聚糖/ＤＮＡ纳米粒子在无配体受体相互作用下可穿过细胞膜。Chan V等[19] 过研究壳聚糖与二棕榈酰甘油-3-磷酸胆酰(DPPC)膜双层的相互作用,发现DPPC中的疏水链分子间和分子内相互作用力因壳聚糖与膜的强烈作用而显著降低,壳聚糖也降低了酰基链二维堆积的有序性,使DPPC膜的扰动性提高,增加了DPPC双层的流动性。这一实验结果揭示了壳聚糖跨膜的机理。
朱诗国等[20] 同时应用有机和无机材料进行复合纳米颗粒基因传递载体的研究，用微乳液法合成了硅纳米颗粒(silica nanoparticle,SiNP)，并通过正交分析阐明了该体系中各组分对硅纳米颗粒径及其分布的影响。然后用多聚赖氨酸（poly-L-lysine,PLL）进行修饰，使SｉNP表面改性，发现制备的多赖氨酸硅纳米颗粒能有效结合DNA，并能保护DNA免遭DNａｓｅI降解；进一步的细胞转染研究表明，PLL-SINP具有较高的细胞转染效率，是一种新型的非病毒纳米DNA传递载体。
6 分子偶联体
分子偶联体（molecular conjugates）是外源DNA通过某种方式共价结合到细胞表面特异受体的配基或单克隆抗体或病毒胞膜蛋白等，利用特异的结合特性而介导外源基因导入到某一类型的细胞中。因为外源裸DNA或复合物在进入靶细胞后，DNA需要逃避内吞小泡、溶酶体及胞浆中核酸酶的降解与破坏，加之对其的一些物理化学性质仍不明了，研究人员仍需进一步努力，以解决基因治疗所面临的基因导入系统的问题。
此外，蛋白质多肽介导的基因转导系统，为合成的阳离子多肽复合物载体系统。与阳离子脂质体相比，该系统具有更强的聚合DNA的能力，可靶向转导外源性基因进入受体表达阳性的宿主细胞。最近的研究表明，它们可与DNA形成稳定的微颗粒并用于体内DNA的转导。
客观地讲,非病毒载体系统仍存在着许多亟待解决的问题,诸如高分子的降解速率、细胞和基因毒性(genotoxicity)、DNA的酶解、跨越细胞膜的屏障、DNA从载体上解离和释放，以及DNA转染至目标细胞核内的障碍等[21]。
目前,非病毒载体系统所面临的共同问题是，外源基因转导到宿主细胞后表达时间短，且基因表达关闭的机制不明确[22]，同病毒载体相比，非病毒载体转移效率不高，进入临床还需要更深入的基础研究，但无疑是未来研究的方向。参考文献：
Progress in the Nonviral Vectors of Gene Therapy
LIU Wen－sheng, LIU Gui－lin,WEI Ping
（College of Agronomy,Shanxi Agriculture University，Taigu,Shanxi,030801,China）
Abstract: The vectors of gene therapy include viral vector and nonviral vector. For the problems of the safety of viral vector, at present, the research of nonviral vector is important. Nonviral vectors is a newly gene delivery system which has lowertoxicant,less immune reactions, lower probability of gene integration, and nonlimitation of gene insertion clip size,it also has other characteristics such as the convenience of the use and preparation, easy conservation and probation. As a normal nonviral vector, liposome was easily to be prepared and has high safety to be preserved, but it was so hardly to get the requirement of quality control. For the lower efficiency of gene delivery in vivo and problems of target, its application was limited. The research of pHsensitive liposome and positive ion liposome increase the efficiency of delivery of liposome. And the application of the high polymer carriers and nanoparticle in the gene therapy has open up a vast range of prospects for making use of nonviral vector in clinical practice.
Key words: gene therapy；high polymer carriers；liposome；nanoparticle carriers
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