|
|
 |
支持与服务 |
|
 |
 |
| GenEscort™II使用说明 |
|
| GenEscort™II使用说明 |
下载本说明 (doc)  (pdf) |
一．产品介绍
GenEscort™II是一种多功能的转染试剂，该试剂由可生物降解的分枝状PEI衍生物与其它组分复合而成。特别适用于各种贴壁细胞的转染，对绝大多数贴壁细胞系具有优秀的转染效率，可以转染原代细胞和悬浮细胞，可进行寡核苷酸和siRNA运送。也能用于体内的动物实验。
GenEscort™II与传统的脂质体相比无论在转染效果和实验操作上都有明显的优势，主要表现为：
对绝大多数贴壁细胞有较高的转染效率
可用于转染原代细胞和悬浮细胞
操作简单，结果重复性好
转染试剂/DNA复合物的形成时间只需10-15min，可以在最短的时间内完成转染
转染试剂/DNA复合物可以直接加入完全细胞培养基中，
血清和抗生素不影响其转染效果
细胞毒性低，转染前后不需要更换培养基，不用去除转染试剂
需要较少的转染条件优化
二．运输与储存
运输：常温
储存：2－8℃ 一年； －15℃至―20℃ 二年以上
三．转染前的准备与注意事项
1．细胞接种
为了取得较高的转染效率，推荐使用在50代以内的细胞进行转染实验。要求在转染前24小时对细胞再次传代，在培养基中加入抗生素对转染效果没有影响。转染时细胞密度一般应为60-80%，但这因细胞株的不同而变化，对最常用的细胞株建议细胞密度为70-90%。以24孔板的转染为例，最理想条件是在转染前24小时，每孔接种(500 μl )0.5－2×105个细胞。在大多数情况下，如果在细胞贴壁后(接种几小时后)即进行转染，也可以得到相近的结果。表1列举了不同细胞培养装置的推荐细胞数量。
2．DNA的质量
为了取得较高的转染效率，推荐使用高纯度的质粒。仅仅根据DNA电泳条带的情况估计DNA的量和纯度是不够准确的。建议对提取的质粒DNA的量和纯度进行检测，DNA含量 (μg/mL)=50 × (260 nm的读数) × 稀释倍数，通过检测质粒DNA在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度，OD260/OD280值应该≥1.8。转染时不同品质的DNA用量不同，以24孔板转染为例，使用酚氯仿沉淀法提取的质粒DNA一般每孔需要加入≥2μg质粒DNA，而使用Qiagen分离柱或类似方法提取的质粒DNA一般每孔需要加入0.5-1μg质粒DNA。
表 1 不同细胞培养装置转染前一天细胞接种的推荐细胞数量
为了提高转染效率可以首先使用低细胞培养液总体积，转染 2－3 h 小时后补加一倍的含血清细胞培液。
3．血清的影响
与大多数脂质体转染试剂不同的是，在转染过程中细胞培养基中包含血清反而可以提高转染效果。但是在GenEscort™Ⅱ 和DNA形成转染复合物的过程中不能添加血清。转染复合物的制备过程中可以使用不含血清的培养基或细胞实验室常用的PBS稀释质粒DNA和转染试剂。
4．GenEscort™Ⅱ 的用量
在体外细胞转染试验中，对于接种细胞密度在60%-90% 之间的实验样本，可通过预试验在GenEscort™Ⅱ（μl）∶DNA（μg）= 2∶1 － 6∶1之间选择最佳的比例。对大多数细胞GenEscort™Ⅱ（μl）∶DNA（μg）的推荐比例为2∶1。
在动物体内转染试验中，动物肿瘤模型的建立需要根据研究情况进行选择；核酸的给药剂量可根据需要进行调整，其与GenEscort™Ⅱ 的使用比例最好通过体外细胞水平的实验确定，但通常DNA/RNA/siRNA/（μg）：GenEscort™Ⅱ（μl）1:2 － 1:3；核酸的给药途径可根据研究情况确定，可选择静脉注射、肌内注射、瘤内注射、腹腔注射等。
5．PBS配制方法
800ml蒸馏水中溶解8g NaCl, 0.2g KCl, 3.63g Na2HPO4.12H2O(或1.44g Na2HPO4) 和0.24g KH2PO4, 用HCl调节溶液pH 至7.4加水定容至1L，高压灭菌20分钟，保存于室温。（见“分子克隆实验指南” 第二版 P927）
四．操作步骤
贴壁细胞转染(以24孔板转染为例)
1 μg DNA质粒稀释于50 μl 不含血清和抗生素的培养基中，轻轻混匀。
注: PBS (pH 7.4) 缓冲液，即前述细胞培养室常用的PBS 以及 opti MEM (Invitrogen) 也能用于稀释DNA和转染试剂。
2 μl GenEscort™Ⅱ 稀释于50 μl 不含血清和抗生素的培养基中，轻轻混匀。
注: PBS (pH 7.4) 缓冲液，即前述细胞培养室常用的PBS 以及 opti MEM (Invitrogen) 也能用于稀释转染试剂和DNA。
50μl GenEscort™Ⅱ 稀释液滴加到50 μl DNA稀释液中，轻轻混匀, 室温孵育 10-15 分钟，从而获得100 μl GenEscort™Ⅱ/DNA 复合物。
为简化操作，在充分注意及时混匀的前提下，前面几步可以合并为一步完成：将1 μg DNA 质粒稀释于100 μl 不含血清和抗生素的培养基或PBS中，轻轻混匀，然后加入 2 μl GenEscort™Ⅱ 后立刻混匀，室温放置10-15 min，获得100μl 转染复合物。
注意！: 两种溶液的混合顺序对转染结果非常重要，切勿颠倒顺序。同时室温孵育时间最好不超过20分钟，然后立即加入到培养基中。通常将孵育10-15 分钟后GenEscort™Ⅱ/DNA 复合物与培养基在EP管中混合后再加入每孔中转染效果更好。
100μl GenEscort™Ⅱ/DNA复合物滴加到每孔中并轻轻摇动使其与新鲜的培养基均匀混合。
注: 接种细胞的0.5 ml - 1 ml 的培养基，在进行转染时已经24小时了，如果已经发黄，最好在转染时更换为新鲜的培养基
把细胞放置在37℃，CO2孵育箱孵育24-48小时后，分析报告基因转染效率。
悬浮细胞转染
为了提高转染效率可以首先使用低细胞培养液总体积（见表 1细胞培养液总体积的下限或更低一些），转染2-3 h 小时后补加一倍的含血清细胞培液。以24孔板转染为例，具体为以细胞培养液总体积的下限（500μl ）接种细胞2小时后，加入同样方法制备的100 μl GenEscort™Ⅱ /DNA 复合物，轻轻摇动使均匀混合，转染2 h 小时后补加含血清细胞培液至总体积1 ml，继续培养至24-48小时后，分析报告基因转染效率。
表 2 在不同细胞培养装置转染时，制备转染复合物各组分的使用量
高通量系统实验步骤 (在96-孔板上的转染)
转染复合物的制备
对每孔, 在EP管中将200 ng DNA 稀释于15 μl PBS 中, 轻轻混匀。
对每孔, 在EP管中将0.4 μl 的GenEscort™Ⅱ 溶液稀释于15 μl PBS 中, 轻轻混匀。
将15 μl GenEscort™Ⅱ 稀释液加到15 μl DNA 稀释液中，轻轻混匀。
注意: 两种溶液的混合顺序对转染结果非常重要，切勿颠倒滴加顺序。
轻轻振荡混匀后，室温下静止10-15分钟后，立刻加入到每孔中。
细胞的接种与转染
细胞经胰酶消化后，用新鲜的含血清的培养基洗一次，然后在96孔板上接种细胞，每孔200 μl 20 000个细胞, 细胞培养24小时后进行转染。
将上述制备好的30 μl GenEscort™Ⅱ/DNA 复合物滴加到每孔中，轻轻摇动细胞培养板使转染复合物均匀分散。
在37°C，5% CO2下培养。24 – 48小时后，分析报告基因转染效率。
动物体内转染
质粒DNA（或其他核苷酸类成分）用量与GenEscort™Ⅱ 的使用比例最好通过体外细胞水平的实验确定，但通常DNA/RNA/siRNA/（μg）：GenEscort™Ⅱ（μl）为1:2 － 1:3；核酸的给药途径可根据研究情况确定，可选择静脉注射、肌内注射、瘤内注射、腹腔注射等。
以小鼠瘤内注射进行基因治疗为例：
(1) 肿瘤细胞株接种于小鼠背部皮下，定期用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100 mm3后将动物随机分组给药。肿瘤体积(tumor volume ,TV)的计算公式为：
TV = 1/2 × a × b2 其中a、b分别表示长宽。
(2)10μg（1μg/μl）质粒（或其他寡核苷酸类成分）与20μl PBS在1.5 ml无菌EP管中混匀后，再加入20μl GenEscort™Ⅱ 混匀，室温放置10-15 min，获得50 μl转染复合物。
（3）瘤体局部消毒后，将前述的50μl转染复合物直接注射到小鼠肿瘤内。
（4）动物继续饲养，如需要多次给药，则转染方法按 (2), (3) 进行。定期用游标卡尺测量移植瘤直径，计算肿瘤体积。
（5）处死动物手术剥取瘤块进行分析。
References
1. Boussif O., F. Lezoualc'h, M. A. Zanta, M. D. Mergny, D. Scherman, B. Demeneix and J. P. Behr (1995) A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 7297-301
2. Remy J. S., B. Abdallah, M. A. Zanta, O. Boussif, J. P. Behr and B. Demeneix (1998) Gene-Transfer with Lipospermines and Polyethylenimines. Adv. Drug Delivery Rev. 30, 85-95
3. Horbinski C., M. K. Stachowiak, D. Higgins and S. G. Finnegan (2001) Polyethylenimine mediated transfection of cultured pos™itotic neurons from rat sympathic ganglia and adult human retina. BMC Neuroscience 2, 1471-2202
4. Lambert R. C., Y. Maulet, J. L. Dupont, S. Mykita, P. Craig, S. Volsen and A. Feltz (1996) Polyethylenimine-Mediated DNA Transfection of Peripheral and Central Neurons in Primary Culture Probing Ca2+ Channel Structure and Function with Antisense Oligonucleotides. Mol. Cell. Neurosci. 7, 239-246
5. Mislick K. A. and J. D. Baldeschwieler (1996) Evidence for the role of proteoglycans in cation-mediated gene transfer. Proc Natl Acad Sci
USA 93, 12349-12354
6. Boussif O., M. A. Zanta and J. P. Behr (1996) Optimized Galenics Improve in-Vitro Gene-Transfer with Cationic Molecules Up to 1000-Fold. Gene Therapy 3, 1074-1080
| 问题 |
原因与解决方法 |
| 低转染效率 |
- 优化转染实验中所用的质粒DNA的用量。
- 采用高质量的质粒DNA，并确认其中不含有RNA ( OD260/OD280 大于1.8 )。
- 转染前细胞的密度应达到60-80%，并保证细胞形态是最佳的。
- 优化GenEscort™/DNA 的比值（1μl GenEscort™/μg DNA - 4μl GenEscort™/μg DNA.）。
- 设立阳性对照，例如GFP Gene和luciferase Gene以便检查转染结果。
- 减少转染时细胞培液的体积。
|
| 细胞毒性大 |
- 接种前，细胞的健康状况直接影响细胞毒性。
- 保持GenEscort™/DNA比率的同时减少质粒的数量。
- 核准DNA的浓度，确保GenEscort™/DNA比率为每μg DNA不超过2μl GenEscort™试剂。
- 减少GenEscort™/DNA复合物与细胞的培育时间，转染4小时后可以更换培养基。
- 确定基因表达产物是否有毒性，如果表达的蛋白对细胞有毒性，应该减少转染实验中所用的质粒DNA用量。
- 确认质粒没有内毒素。
|
| 转染结果不重复 |
- 细胞传代次数多，细胞老化，或者细胞分裂条件已经变化。在这种情况下，如果转染结果不可重复，可能是细胞状态不佳，应该从液氮罐里取一只新的细胞株培养并用于转染实验。
- 在不同的试剂/DNA比或不同的细胞密度下，转染效果可能差别较大。所使用DNA的品质变化，所用培养基的改变以及试剂/DNA比的不同都可能导致转染结果的不重复。
|
| |
|
 |
|
|
搜索:
